在前期推送里，我们已经给大家分享了寡核苷酸的荧光基团、淬灭基团修饰，间臂类修饰和特殊碱基修饰。本文是寡核苷酸修饰系列的最后一篇，将给大家分享寡核苷酸化学修饰的应用。以下为一个简略版的表格，具体的例子与结构我们文章里见。

氨基修饰系列

应用：
 

Animo linker 可以在寡核苷酸上修饰氨基，氨基可以和 NHS 酯基发生交联；利用这个化学反应，我们可以往寡核苷酸上连接 NHS 酯基活化其他配体分子，比如染料、生物素等。

寡核苷酸与氨基之间可以被 C6、C7 或 C12 间臂隔开，从而减小氨基与寡核苷酸之间的空间位阻。dT-amino linker 可以让我们在寡核苷酸中间插入氨基，从而在寡核苷酸中间引入荧光基团等。



 

在一些测序方法中，接头引物末端可见修饰 AmC6，用于封闭接头和测序片段连接过程中可能产生的接头互连 [1]。

Amino linker C7 可添加在 3' 端，对于 PCR 扩增有一定的封闭作用。

应用：
 

寡核苷酸化学合成得到的是 3' 端和 5' 端均为羟基的寡核苷酸，并非我们通常认为的 5' 端磷酸、3' 端羟基的寡核苷酸链。因此化学合成的寡核苷酸若需要加磷酸基团，订购时需要特别说明。

寡核苷酸磷酸化修饰主要是应用在连接反应中，T4 DNA 连接酶在连接过程中催化 5' 磷酸末端和 3' 羟基末端形成磷酸二酯键。因此寡核苷酸 5' 端携带磷酸基团更利于连接反应。有小伙伴或许会疑惑，为何我订购引物用于 PCR 并构建载体时从不标注加磷酸修饰却可以成功将 PCR 产物连进载体呢？因为我们用于连接反应的载体通常经过限制酶酶切得到，而限制酶留下的切口是携带 5' 端磷酸基团的。

例如：DEL 引物在 split and pool 过程中，DNA 标签的引入通常使用 T4 连接酶连接得到，因此 DEL 引物通常要求做磷酸化修饰 [2]。

图片来源：Design, synthesis and selection of DNA-encoded small-molecule libraries
 

应用：
 

硫代修饰是在寡核苷酸骨架上进行的修饰，在寡核苷酸链中，磷酸基团的非桥连氧原子被硫原子取代，将磷酸二酯键修饰为硫代磷酸酯键；这种修饰极大地增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。进行硫代修饰后，因为整个分子刚性的增加寡核苷酸的 Tm 值也会略有下降；同时硫代修饰并非越多越好，过量的硫代磷酸酯键可使寡核苷酸变「粘稠」，可能导致假阳性结合。

在 ASO（antisense oligonucleotides）药物中经常使用硫代修饰。以 Fomivirsen 为例，它是第一个被批准上市的 ASO 药物，用于治疗人巨细胞病毒感染。Fomivirsen 骨架上做硫代修饰，可延长其半衰期 [3]。对于 ASO，硫代修饰是可接受的，因其不影响 RNase H 的活性。
 

图片来源：Fomivirsen
 

应用：
 

应用：

寡核苷酸属于亲水性物质，并带有强烈的负电荷，因此寡核苷酸穿过细胞膜比较困难，也是现在核酸药物的挑战之一。改善细胞摄取寡核苷酸的策略之一，是将寡核苷酸与无毒的亲脂性分子相连，胆固醇修饰正是为了帮助寡核苷酸更好地穿过细胞膜。

例如，文献 Cholesterol-functionalized DNA/RNA heteroduplexes cross the blood–brain barrier and knock down genes in the rodent CNS[4] 中，研究者开发了一种胆固醇修饰的 DNA/RNA 杂化双链寡核苷酸分子，可以通过皮下或静脉注射的方式，有效穿过血脑屏障，抑制大脑、脊髓细胞中的靶基因表达，而不需要通过脑脊液给药。

应用：
 

炔基修饰是将一个活化的乙.炔基修饰到寡核苷酸的 5' 端，炔基与寡核苷酸之间存在 4 个碳的间隔，避免不利的空间位阻。炔基的存在可以让我们使用点击化学（其代表反应为铜催化的叠氮-炔基 Husigen 环加成反应）方法，向炔基修饰的寡核苷酸上添加各种叠氮修饰的标签，比如荧光基团、生物素等。

 

巯基修饰系列

应用：

Thiol-C3 S-S 和 Thiol-C6 S-S 用于在寡核苷酸中引入巯基修饰，Thiol-C3 S-S 修饰中巯基与寡核苷酸之间有 3 个碳的间隔，Thiol-C6 S-S 修饰中巯基与寡核苷酸之间有 6 个碳的间隔，可减小巯基与寡核苷酸之间的空间位阻。在寡核苷酸合成过程中，将巯基以二硫化物的形式添加到寡核苷酸中，可以避免化学合成过程对巯基的破坏。因此巯基修饰的引物发货形式是二硫键没有断开的氧化态，当各位小伙伴拿到二硫化物修饰的寡核苷酸时，需要先使用 TCEP 或 DTT 将其还原为巯基（见上方结构式），再进行后续实验。

通过引入巯基，研究者可以在寡核苷酸上连接被碘.乙酰胺或马来酰亚胺活化的配体（比如染料、生物素等）。

生物素修饰系列


 

应用：
 

Biotin 即生物素，与链霉亲和素可紧密结合。标准的 biotin 修饰与寡核苷酸的连接处有 6 碳间臂；biotin-TEG 是在 biotin 和寡核苷酸连接处有聚乙二醇臂；这些间臂可以减少 biotin 与寡核苷酸之间的空间位阻，更利于链霉亲和素捕获 biotin。biotin 可以修饰在寡核苷酸的 5' 和 3' 端；也可以使用 biotin-dT 将 biotin 修饰到寡核苷酸的中间。

生物素与链霉亲和素的结合是不可逆的，并且可以耐受极端的 pH 和离子强度的洗涤，因此 biotin-streptavidin 组合广泛应用于各种分离检测实验，研究者可以通过调节洗涤条件得到较为特异的结果。

1）核酸分离：如杂交捕获探针

2）杂交检测，比如 RIP 实验。

图示为杂交捕获原理
 

到这里我们修饰系列的推送已经分享完毕了。我们可以发现，总的来说，寡核苷酸修饰的作用可分为几类：提供荧光标记、提高稳定性、提供相互作用表位、提高 Tm 值，还有帮助递送等；修饰赋予了寡核苷酸更多的性质，为各类生物技术的应用提供了支持。

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参考文献：

[1] Gansauge, M. T., Gerber, T., Glocke, I., Korlevic, P., Lippik, L., Nagel, S., Riehl, L. M., Schmidt, A., & Meyer, M. (2017). Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic acids research, 45(10), e79.

[2] Clark, M. A., Acharya, R. A., Arico-Muendel, C. C., Belyanskaya, S. L., Benjamin, D. R., Carlson, N. R., Centrella, P. A., Chiu, C. H., Creaser, S. P., Cuozzo, J. W., Davie, C. P., Ding, Y., Franklin, G. J., Franzen, K. D., Gefter, M. L., Hale, S. P., Hansen, N. J., Israel, D. I., Jiang, J., Kavarana, M. J., Morgan, B. A. (2009). Design, synthesis and selection of DNA-encoded small-molecule libraries. Nature chemical biology, 5(9), 647–654.

[3] Perry, C. M., & Balfour, J. A. (1999). Fomivirsen. Drugs, 57(3), 375–381.

[4] Nagata, T., Dwyer, C. A., Yoshida-Tanaka, K., Ihara, K., Ohyagi, M., Kaburagi, H., Miyata, H., Ebihara, S., Yoshioka, K., Ishii, T., Miyata, K., Miyata, K., Powers, B., Igari, T., Yamamoto, S., Arimura, N., Hirabayashi, H., Uchihara, T., Hara, R. I., Wada, T., Yokota, T. (2021). Cholesterol-functionalized DNA/RNA heteroduplexes cross the blood-brain barrier and knock down genes in the rodent CNS. Nature biotechnology, 39(12), 1529–1536.  

 

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