在生物样本库和细胞治疗行业中，基于气相液氮（LN2）的存储系统储存样本十分常见。这类液氮罐能够提供低于-150℃的储存环境，从而将样本保持在-135℃以下，即水的玻璃化转变温度（Tg）。这种低温储存方法保持了样本的活性。

令人担忧的是，在常规冻存架暴露过程中，无关样本（不需要解冻的样本）可能会受到影响。数以千计的无关样本在整个储存期间可能会多次暴露。在玻璃化转变阶段持续解冻 / 冷冻可能会造成不可逆的损坏，并在解冻时影响样本功能。

之前的文章我们分享了将-80℃样本放入-190℃自动化液氮存储系统的冷却速率实验结果，常规冻存架抽取期间无关样本的升温速率，以及每次冻存架抽取造成的热量损失，最后提供了针对将预冷却-80℃生物样本放入气相液氮罐的最佳实践（回顾文章：白皮书 | -80℃到-190℃的样本存储实践）。但是手动存储和自动存储的差异常被提及，差异很大，是否能被量化？于是我们比较了使用手动和自动系统处理的无关样本的工作流程、时间和升温速率。 



使用手动 LN2 液氮罐的典型工作流程，在从液氮罐取出（拉出）冻存架期间，对标准冻存架中五个不同搁板位置的样本（水）进行监控。使用 BioStore -190℃深低温自动化存储系统（BioStore），并使用相同设置和位置重复该实验。

材料

• BioStore-190℃深低温自动化存储系统（BioStore）
• Chart MVE 1500 系列 LN2-190℃蒸汽液氮罐（ARD），带冻存架
• 5 个 Azenta 10 x10 带盖冻存盒
• 5 个 Azenta 2mL 冻存管，放置在每个冻存盒的中心位置
• 所有冻存管装满 2mL 水
• 36 AWG T 型热电偶安装在水位中间
• 测量计算 TC-Temp 数据采集设备，使用 TracerDAQ 软件以 1.0hz

方法

1. 2mL 冻存管装满 2mL 水并安装细线热电偶
2. 将冻存管放入冻存盒中心位置，盖上盖子，然后将冻存盒分别插入冻存架的搁板 1（顶层）、搁板 4、搁板 7、搁板 10 和搁板 13 中
3. 监控冻存管，直到顶部冻存盒内样本温度达到-180℃±2℃
4. 使用 BioStore 系统取出冻存架 10 次
5. 手动取出冻存架并移到液氮罐一侧 10 次
6. 使用 BioStore 系统取出冻存架并分别放至搁板 1、3、5、7 和 14 上 5 次
7. 不移除、处理或触摸冻存盒

结果

与常规工作流程的对比

手动 LN2 液氮罐中取出样本的工作流程可能因实验室、用户甚至日常情况而异。由于整个过程手动完成，因此不会自动监控和记录无关样本暴露、取出时间和库存。

手动 LN2 液氮罐中取出冻存盒的标准步骤：

1. 走上脚梯
2. 取下盖子
3. 向内伸手转动转盘，找到所需的冻存架
4. 将冻存架向上提起并取出
5. 把冻存架放在液氮罐上，或者走下来放在工作台上或底板上
6. 打开冻存架固定卡扣
7. 找到并移除所需的冻存盒
8. 锁定冻存架固定卡扣
9. 将冻存架提起，然后放回液氮罐
10. 盖上盖子
11. 走下脚梯

从 BioStore 系统中取出冻存盒的标准步骤：

1. 将样本编号或位置输入电脑并提交
2. 出现提示（冻存架升高）时，打开门并移动冻存盒
3. 冻存架会自动收回到液氮罐

用时对比

使用手动液氮罐，每个冻存盒的取出可能需要不同的时间，这取决于其在液氮罐中的位置以及操作者的速度和准确性。以下是估计时间：

• 2 分钟-找到并取出冻存盒的时间
• 30 秒到 2 分钟-冻存架暴露在 LN2 液氮罐外的时间

• 30 到 90 秒-找到并取出液氮罐的时间
• 15 到 30 秒-冻存架暴露在 LN2 液氮罐外的时间

随着自动化的使用，人工劳动大大减少。此外，所有行动和样本暴露都受到控制、监测和记录。

样本升温速率

尽量减少无关样本升温对于保持解冻后样本的功能非常重要。因此，用户必须尽可能限制无关样本在 LN2 低温环境之外的时间。使用自动化流程，可以减少冻存架的暴露时间，并且在冻存架周围增加隔热层，也可以减少样本的升温。

在手动工作流程中，冻存架在液氮罐外的时间一般超过 30 秒。但为了进行同等比较，下图显示了手动和自动冻存架拉出过程中，每个无关样本在环境暴露的前 30 秒升温速率。



对比平均所有搁板的样本升温速率，BioStore 样本在暴露的前 30 秒升温速率比手动流程慢 70%。搁板 1 中的升温速率最高，尽管 BioStore 对于较低搁板具有相对线性的升温速率，但手动冻存架在不同搁板之间具有显著的差异。

注：手动冻存架升温会受到环境的进一步影响。搁板 13（可能还有搁板 14）受到冻存架所在表面的影响，我们发现隔热泡沫提供了最低的热传递。标准空调通风口的室内气流也会影响手动冻存架升温约 30%¹。

搁板位置

下面显示了每个搁板从取出到 -120℃（超过玻璃化转变温度）的升温速率以及达到-120℃的平均时间。



样本温度

以下是使用手动和 BioStore 工作流程暴露 2 分钟期间所有 5 个无关样本的温度。



下图显示了使用 BioStore 系统从搁板 1（顶部）和搁板 7 取回冻存盒时所有 5 个无关样本的温度。请注意，与从 LN2 液氮罐中取出整个冻存架相比，下层搁板样本的温度要低得多。为保护无关样本升温，最好仅将冻存架提升至取出所需冻存盒所需的最小高度。



结论
 

• 与手动操作相比，使用 BioStore 系统时，取出冻存盒的工作流程步骤大大简化；
• 在冻存架取出后的前 30 秒，BioStore 的样本升温速率比手动低 70%；
• 与手动相比，使用 BioStore 无关样本的 Tg 升温时间要长 51%；
• 低层搁板样本在进入较高层搁板箱时需保存在液氮罐内，防止 BioStore 系统过度升温；
• 如果手动取出冻存架，需要彻底了解升温速率、环境变量和影响因素。制定 SOP 并定期审核，以确保高价值样本始终安全保持在 Tg 以下；
• 将任一冻存架放回 LN2 液氮罐后，样本将继续升温，不同的样本体积将以不同的速率升温，即 1mL 冻存管的升温速度比 2mL 冻存管快约 60%2 。

参考文献：
1 Warhurst, J., Fink, J., Holmes, T. et al. (2015 May).Protection of innocents: continued sample warm up after return to a cryogenic environment (below -150°C) following a transient ambient picking operation. Oral presentation presented at annual International
Society of Cellular Therapy conference, Las Vegas, NV.
2 Salvetti, M., Fink, J. Barlett, A. et al. (2015, May). Thermal excursions of cryogenically frozen vials (below -150°C) and the risk of rising above Tg,H2O: analyzing warm-up rates from cryogenic storage to both dry ice and ambient temperature environments.
Poster presented at annual International Society of Cellular Therapy conference, Las Vegas, NV.