背景介绍

质粒（Plasmid）是发现于细菌、真菌等生物中拟核或细胞核以外的闭合环状双链 DNA 分子，具有自主复制能力。游离质粒可以随着宿主基因组复制而复制，并随细胞分裂分离到子代细胞中，能保持恒定的拷贝数，表达所携带的遗传信息。基于该特征，质粒作为承载目的基因的重要载体，被广泛地应用在生命科学研究、药物开发、细胞与基因治疗及临床研究等领域中。

质粒 DNA 在细胞与基因治疗（CGT）、基因编辑等领域的具体应用包括：

1、裸质粒治疗药物：裸质粒作为基因表达载体，作为蛋白疗法的替代方案；

2、DNA 疫苗：裸质粒作为抗原编码基因的载体，用作预防性或治疗性 DNA 疫苗；

3、病毒载体原料：重组质粒可用于组装慢病毒 (LV)、腺相关病毒 (AAV)，用于细胞与基因治疗或基因编辑；

4、mRNA/siRNA 原料：线性化质粒作为 mRNA 体外转录模板，是 mRNA/siRNA 药物的重要上游原料。

(DOI: 10.18609/cgti.2023.094)
 

质粒序列鉴别的必要性及当前痛点问题

质粒放行质控对确保生物制药产品的质量和安全性至关重要，但目前定义质粒作为起始材料放行预期的指南是有限的。今年 1 月份 BioPhorum Operations Group (BPOG) 发布的《Release Specifications For Plasmid MCBs, Plasmid DNA》文章中总结了关于该主题的关键行业反馈、最佳实践和成员讨论。

文章中总结了质粒 MCB 和质粒 DNA 质量分析的类别（即鉴别、纯度和效力）和属性以及建议的方法和验收标准。其中特别强调了质粒鉴别序列一致性验证是 FDA 对任何起始材料在用于药物制造过程之前的要求。质粒序列一致性测试需要在质粒供应商放行时进行，也需要由用户在使用前进行。在执行质量控制放行测试时，供应商可以使用测序和/或限制性消化图谱作为鉴定方法。

一般来说，供应商应该对整个质粒序列进行测序，并与参考序列进行比较，同时使用限制酶消化可能有助于定性指导。

然而，行业认识到传统的 Sanger 测序可能很困难，并且由于复杂的挑战需要特殊的方法调整。这源于某些质粒 DNA 中存在的序列区域的重复性质（如长末端重复 [LTR] 和反向末端重复 [ITR] 序列区域）。作为补充，应使用高通量测序 NGS 技术，它们具有增强的检测能力，可以对质粒 DNA 的复杂区域进行测序验证。

目前，虽然已有 Sanger 测序及 NGS 测序等技术用于质粒序列鉴别，但在此过程中还是会遇到各种各样的问题。

01）质粒的不稳定性

重组质粒在构建及培养过程中有可能由于 DNA 的插入、缺失或重排等引起结构的不稳定；在传代过程中，大肠杆菌或其他宿主细胞会竭尽全力避免表达质粒转入的外源基因，并且会以意想不到的方式对质粒序列结构进行修改，而这些改变基于目的基因的 Sanger 测序不太容易检测到。

02）超长质粒

随着基因合成及分子克隆技术的发展，质粒的外源插入序列也越来越长。普通 Sanger 测序需要设计测序引物，经过多轮 Walking 测序，成本很高，速度很慢，且容易失败。

03）结构复杂的质粒

普通 Sanger 测序遇到高 GC 区域经常会发生测序中断的情况，遇到串联重复区域则无法设计引物。大片段重复区域是 Sanger 测序和 NGS 短读长测序都很难克服的障碍。

04）混合质粒

在实验室操作过程中质粒样本中可能会引入其他质粒的气溶胶污染，而在质粒的大量生产过程中 CMO/CDMO 会将不同质粒共线生产，也会造成不同质粒间的相互污染，那最终的产品可能就不是理想中的单克隆质粒了，Sanger 测序基于目标克隆序列设计引物测序无法检测到混合质粒的存在。

05）多聚体质粒

一般而言，绝大多数质粒在重组大肠杆菌中都能稳定传代，但比如 mRNA 模板质粒由于其特殊的 Poly(A) 结构，在重组酶的作用会导致二聚体、四聚体等多聚体的产生。如何确定样本中是否存在多聚体，传统的 Sanger 测序不会告诉你答案。
 

Plasmid-EZ 在质粒序列鉴别中的应用

为解决上述痛点问题，安升达开发了高通量全质粒测序方法 Plasmid-EZ，可以快速高效地获得完整准确的质粒序列。该方法不仅可以解决结构复杂、重复片段等测序难题，还能够发现骨架缺失、重组及多聚体等样本情况，是质粒序列鉴别的最佳解决方案。

案例一 -- Plasmid-EZ 应用于结构复杂质粒全长序列验证

含高 GC 区域的质粒

含短串联重复序列的质粒

Sanger 测序在高 GC 区域易发生错误或提前测序终止，重复序列下游易出现信号变差、碱基错误问题。Plasmid-EZ 对于这些复杂结构能够稳定测序并组装出正确的序列。

案例二 -- Plasmid-EZ 应用于 AAV 包装质粒的全长序列验证

（上图中蓝色底色为 ITR 区域）

AAV 质粒 ITR 区域的完整性对重组腺相关病毒 (rAAV) 的产生至关重要。因此，对 AAV 质粒的 ITR 序列进行准确的分析对 rAAV 的质控具有重要的意义。但 ITR 区域由高 GC 含量和长的回文序列组成的 T 型发夹结构，会抑制普通 Sanger 测序中的聚合酶链式反应，导致测序发生错误或失败，而 Plasmid-EZ 可以对 AAV 质粒包括 ITR 区域成功测序。
 

案例三 -- Plasmid-EZ 应用于含大片段重复质粒全长序列验证

含大片段重复序列的质粒，由于重复区域过长，传统的 Sanger 测序通过 primer-walking 会受到限制。二代短读长测序会出现组装不完整的情况，通过 plasmid-EZ 组装发现了两段序列相似度高达 98.8% 的 2.2k 的重复片段，二代组装出两条共 7.4kb 的长度，而 plasmid-EZ 组装出完整的 9.4k 的质粒，且与参考序列一致性达到 99.99%，仅有 1 个碱基不一致。

案例四 -- Plasmid-EZ 应用于质粒多聚体全长序列验证

质粒在复制过程中可能会出现聚体，传统的 Sanger 测序或凝胶电泳比较难以判断多聚体的存在和具体大小。通过 Plasmid-EZ 测序，基于测序读长分布图及质粒理论大小，可组装出多聚体全长序列。

案例五 -- Plasmid-EZ 应用于较大质粒全长序列验证

对于较大质粒，测试了从 20 多 kb 到 50 多 kb 几个不同大小的质粒样本，Plasmid-EZ 均可以成功组装，并验证序列完整成环。

AZENTA Plasmid-EZ 方法优势总结

Plasmid-EZ 不需要已知序列信息，也不需要设计测序引物，对质粒的大小、序列结构复杂度等没有限制，可以提供完整质粒图谱及可交互的网页版分析报告，能够为质粒鉴定提供更完整更全面的信息，包括质粒骨架缺失或重组、检测多聚体质粒及混合质粒等，在价格和交付周期上均有强大的市场竞争力。

另外，依托安升达基因组学（金唯智）不同技术平台，我们可以给客户提供质粒完整解决方案，包括基因合成与克隆、质粒制备、目标区域的 Sanger 测序和 primer-walking 等。

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