核酸药物在遗传疾病、代谢疾病、病毒感染等疾病的治疗上拥有巨大潜力，有望成为继小分子药、抗体药之后的第三大类药物。近年来随着核酸合成技术、修饰类型和递送系统的不断迭代，mRNA疫苗与小核酸药迅速发展，推动了tRNA疗法的发展。

 

tRNA的结构

tRNA的碱基数在76~90个，由于序列内部存在碱基互补配对，tRNA在二维结构上呈现 “stem-loop”的“三叶草”结构。从序列的5'端到3'端，“stem-loop”结构可被描述为：氨基酸接受臂，D臂, 反密码子环, 可变环和T臂。D臂以环中存在二氢尿嘧啶 (dihydrouracil) 命名；T臂，也称为TΨC臂，因为臂上具有保守的胸腺嘧啶，假尿嘧啶和胞嘧啶而命名，负责与核糖体相互作用。可变环则是因为其长度可变而得名[1]。

tRNA上有两个单链区域对于翻译有重要作用，一个是3个碱基组成的反义密码子，它通过与mRNA上的密码子结合实现翻译的特异性；另一个是3'端的CCA acceptor，其羟基可与氨基酸共价连接 (氨酰化)，让tRNA起到运载氨基酸的作用。负责将氨基酸装载到tRNA上的酶称为氨酰-tRNA合成酶。CCA的5' 端碱基也没有与之互补配对的碱基，因为这个碱基对氨基酰化的特异性（即tRNA携带哪种氨基酸）具有重要作用，被称为“鉴别器”。

在三维结构上，tRNA主要是通过T臂与D臂之间的相互作用，将自身折叠成L型结构。L型结构在大多数物种中保守，但是具体的细节存在差别。

图1 tRNA的结构，图片来自文献Transfer RNAs: diversity in form and function

 

tRNA的修饰

在所有的RNA中，tRNA经历了数量最多、化学多样性最强的转录后修饰。目前为止，在原核生物中已经鉴定出超过100种化学修饰，其中许多修饰在生物体之间、在细胞核和细胞器之间是保守的。

修饰在tRNA的各项功能中发挥重要作用，包括tRNA的结构、稳定性、氨基酰化和翻译。比如与体外转录得到的未修饰的tRNA相比，天然的修饰的tRNA表现出溶解温度的增加，整体稳定性的增强。在反密码子环处的修饰可通过阻碍翻译过程中的移码，增加翻译的正确性。tRNA 34位置的修饰与遗传密码的摆动性有关；37位置的修饰可以调节密码子-反密码子相互作用的稳定性。同时，还有很多tRNA修饰的作用有待研究[2]。

但有意思的是，大多数体外转录的tRNA也能进行氨基酰化。这表明功能性的tRNA并不严格需求太多的修饰，未修饰的tRNA也具有运载氨基酸，解码密码子的基本生物活性[3]。

图2 tRNA的修饰，图片来自文献Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease

 

tRNA治疗

目前对于基因突变导致的遗传疾病，科学家们致力于在DNA层面进行治疗，例如使用病毒载体外源表达基因DNA或者是使用基因编辑改造原有的DNA，但这两种方法并非灵丹妙药，比如担忧这类疗法对人体基因组有潜在影响，比如过长的表达片段导致病毒包装困难。加上LNP递送在mRNA疫苗中的成功给了研究者信心。因此，不影响DNA，又能做精细调节的tRNA疗法逐渐受到重视[4]。现在进展较快的是使用tRNA治疗无义突变引起的疾病。

图3 tRNA治疗公司Alltrna，图片来自公司官网https://www.alltrna.com/

遗传密码解码的过程是由DNA转录出mRNA，mRNA上存在三联体密码子，密码子由tRNA上的反密码子解码，翻译出蛋白质。为了翻译出成熟的蛋白，核糖体必须在编码序列的正确位置终止翻译；在真核生物中，翻译终止需要eRF1蛋白（真核生物释放因子1）解码正常的终止密码子（normal terminal codon, NTC）。然而除了正常存在的终止信号，编码序列中间也存由于突变导致的过早终止密码子（premature termination codon, PTC；UAA，UAG，UGA），这种突变称为无义突变（nonsense mutation），导致蛋白翻译过早终止，产生截短的无功能甚至是有害的蛋白质；细胞为了避免PTC导致的有毒蛋白出现，会快速降解存在PTC的mRNA，称为nonsense-mediated decay（NMD）。在人类遗传病中，由PTC导致的疾病约有11% ，比如我们较为熟悉的高中生物课本上的例子——囊性纤维化，部分患者是由于CFTR基因产生无义突变。

目前，对于PTC导致的疾病的治疗手段是采用一些诱导通读的化学小分子，比如庆大霉素或ataluren，它们与核糖体的解码中心结合并改变其翻译保真度，从而允许近同源的氨酰-tRNA通读终止密码子，达到抑制PTC的目的。但是这类药物作用有限且副作用大。现在科学家们正尝试通过引入人为设计开发的tRNA，通过识别突变产生的终止密码子信号掺入所需的氨基酸，以合成完整蛋白质。在治疗PTC引起的疾病方面，tRNA与其他基因疗法相比还有一个显著优势，即单个tRNA制剂可以用于治疗多种与无义突变相关的疾病，因为这些疾病往往具有同一个氨基酸密码子突变成的PTC。

图4 mRNA中PTC的产生导致核糖体翻译终止，产生截短的蛋白和导致mRNA 降解（NMD），图片来自文献Therapeutic promise of engineered nonsense suppressor tRNAs

去年5月，德国University of Hamburg的Zoya Ignatova团队与Arcturus Therapeutics团队合作，发表了Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo 文章[5]。

图5 文章封面

 

文章中作者通过对3种人tRNA家族， tRNASer, tRNAArg和tRNAGly做改造，得到反密码子与PTC互补配对的sup-tRNA（sup-tRNA的sup意为suppressor，因为诱导PTC通读的治疗方法称为nonsense suppression therapy）；随后又对这些sup-tRNA的AC-茎和TΨC茎做改造，体外的荧光素酶报告系统实验和小鼠体内实验均表明改造后的sup-tRNA通读效率提高。

并且通过核糖体图谱表明sup-tRNA并没有严重地引起天然终止密码子的通读。这或许是由于NTC所处位置的序列背景与PTC有较大不同。关于这个问题已经有不少文献做过研究，在这里不做阐述；这个结果也为tRNA治疗提供了安全性前提。有兴趣的读者可以阅读原文献，在这里仅做简单介绍。

图6  图片来自文献Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo，左边实验结果展示通过改造可筛选到通读效率较高的tRNA变体；右边实验结果展示在小鼠肝脏与肺部模型中，tSA1T5具有抑制PTC的效果；肝脏实验模型：尾静脉注射包裹PTC akaluciferase（R208X） mRNA和tRNA的脂质体，图中可见注射tSA1T5的小鼠表达荧光素酶；肺部实验模型：气管内微量喷雾滴注包裹PTC-cre mRNA(包含两个UGA PTCs : S69X and S82X ) 和tRNA的脂质体，图中可见由免疫组化检测到注射tSA1T5的小鼠肺部表达cre。

目前tRNA疗法尚处于临床前研究，其开发难度相对于小干扰RNA药物也更大。但是随着tRNA研究的深入，寡核苷酸化学、生物信息学的进步，递送系统的突破，tRNA疗法正在逐渐形成体系，有望为基因治疗的新选择。

 

客户订购案例——77 nt tRNA

LC-MS结果显示，目标区域峰值百分比为98.5%，理论分子量为24843.9，实测分子量为24845.0。

 

参考文献：

[1] Berg, M. D., & Brandl, C. J. (2021). Transfer RNAs: diversity in form and function. RNA biology, 18(3), 316–339. https://doi.org/10.1080/15476286.2020.1809197

[2] Kirchner, S., & Ignatova, Z. (2015). Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease. Nature reviews. Genetics, 16(2), 98–112. https://doi.org/10.1038/nrg3861

[3] Lorenz, C., Lünse, C. E., & Mörl, M. (2017). tRNA Modifications: Impact on Structure and Thermal Adaptation. Biomolecules, 7(2), 35. https://doi.org/10.3390/biom7020035

[4] https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug-discovery/tRNA-therapies-help-restore-proteins/99/i34

[5] Albers, S., Allen, E. C., Bharti, N., Davyt, M., Joshi, D., Perez-Garcia, C. G., Santos, L., Mukthavaram, R., Delgado-Toscano, M. A., Molina, B., Kuakini, K., Alayyoubi, M., Park, K. J., Acharya, G., Gonzalez, J. A., Sagi, A., Birket, S. E., Tearney, G. J., Rowe, S. M., Manfredi, C., … Ignatova, Z. (2023). Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo. Nature, 618(7966), 842–848. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06133-1

[6] Wangen, J. R., & Green, R. (2020). Stop codon context influences genome-wide stimulation of termination codon readthrough by aminoglycosides. eLife, 9, e52611. https://doi.org/10.7554/eLife.52611

 

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