单细胞转录组测序，是指在单细胞水平上进行 RNA 测序的技术，它可以获得某种细胞类群层面大量的差异表达基因及其功能的信息。蛋白质组是细胞功能和状态的直接描述，mRNA 通过被翻译成蛋白质进而行使功能，所以蛋白质是生命活动最主要的承担者。

单细胞转录组与蛋白组联合一般研究思路为：通过蛋白组学筛选得到候选蛋白标志物，在单细胞层面分析候选蛋白的来源细胞类群，这一步具体是通过对差异表达蛋白所对应的基因表达量鉴定来实现的。

应用方向

疾病诊断、药效评定等方向蛋白标志物的鉴定及转录层面的差异机制挖掘。对于一些难以取到对应组织的疾病样品，可以先从血浆样本入手，初步进行蛋白标志物鉴定，待锁定候选基因后，进一步准备样本进行单细胞转录组测序可以显著提升发文层次。

应用组学

定量蛋白质组、单细胞转录组测序 、常规 RNA-seq

样本及产品选择策略

蛋白组学

临床样本：5 个以上生物学重复

细胞系样本：3 个以上生物学重复

临床样本个体异质性较强，所以为了避免某个样本对整体结果造成较大影响，推荐生物学重复在 5 个以上；细胞系样本每个生物学重复之间稳定性较强，所以建议生物学重复在 3 个以上即可。

同批进行质谱分析的项目中若样本数小于 16 个，推荐 TMT 定量蛋白质组产品；大于 16 个，推荐 label free 非标签定量产品。Label free 不受样本数量限制，但是鉴定到的蛋白数量有限，TMT 受到样本数量限制但鉴定到的蛋白数量更多。

单细胞转录组测序

新鲜细胞悬液样本，建议设置比较组合及 2 个以上的生物学重复。若前期候选蛋白较为确定可以不设置比较组合，专注于寻找表达目标蛋白所属的细胞类群并进行下一步探究。

常规 RNA-seq

在对目标蛋白进行功能验证时，可以通过常规 RNA-seq 挖掘目标蛋白如何影响生物体发生变化。生物学重复建议 3 个以上。比较组合通常为过表达 / 敲降候选基因细胞、动物模型 vs 正常细胞、动物模型。

思路设计



下面我们就通过一篇 2021 年发表在 Cell Metabolism 上的经典文章来探究蛋白组与单细胞转录组是如何联合应用的。


发表时间：2021 年 10 月

发表期刊：Cell Metabolism（IF 31.373）

发表单位：中南大学湘雅医院

应用技术：RNA-seq、单细胞转录组测序、蛋白组

研究背景

骨髓微环境主要包含造血、间充质系细胞，主要功能为支持和调节骨骼的各种细胞类型。在衰老过程中，骨稳态被破坏，主要表现为：低骨转换率和大量骨髓脂肪积累，上述过程最终导致骨质疏松和脆性相关骨折。衰老细胞及其分泌产物目前是骨骼衰老的重要治疗靶点，而免疫系统对于骨骼内稳态和病理学也至关重要。

研究思路


研究结论

• 促炎、衰老亚型的巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞在骨髓中累积。
• 促炎、衰老亚型的免疫细胞可以分泌丰富的颗粒钙素（GCA），促进衰老。
• 颗粒钙素和丛状蛋白 b2 受体结合，抑制其下游信号通路进而抑制骨髓间充质基骨生成，促进骨髓间充质基质细胞的脂肪生成。
• 基于上述研究结果开发了一种颗粒钙素中和抗体并证实了其对老年小鼠的骨骼健康的改善作用。

图：GCA+Plxnb2+FAK 表达网络调控骨骼衰老过程

常见问题

1. 样本准备类：单细胞转录组类测序必须是新鲜样本，其他组学可以是冻存样本。
2. 蛋白组和转录组的关联性较低，蛋白是转录本翻译的产物，所以翻译效率的不同可能很大程度影响蛋白表达。
3. 临床样本生物学重复一致性较差，尽量多取样本，生物学重复建议 5 个以上。


参考文献

1. Li C J ,  Xiao Y ,  Sun Y C , et al. Senescent immune cells release grancalcin to promote skeletal aging[J]. Cell Metabolism, 2021.
2. Chan MY, Efthymios M, Tan SH, et al. Prioritizing Candidates of Post-Myocardial Infarction Heart Failure Using Plasma Proteomics and Single-Cell Transcriptomics. Circulation. 2020 Oct 13;142(15):1408-1421.
3. Fava A, Buyon J, Mohan C, Zhang T, et al. Integrated urine proteomics and renal single-cell genomics identify an IFN-γ response gradient in lupus nephritis. JCI Insight. 2020 Jun 18;5(12):e138345.


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