也许您正手握临床样本，也许您正为新一年的科研指标头疼，也许您还在寻找新的科研方向。只要您有临床样本，都可以考虑研究微生物和疾病的关系。2007 年由美国国立卫生院启动的「人类微生物组计划」（human microbiome project, HMP）极大推进了微生物领域的发展，不仅建立了各类微生物的全基因组序列，而且确认了与人类共生的微生物群会与人体各部位的疾病产生联系这一共识。

以肠道菌群为例，人体胃肠道中的细菌非常复杂，占机体总微生物量的 78.68%，种类超过 1000 种。肠道菌群通过与宿主长期协同进化，建立了密切的关系，已成为宿主机体不可分割的一部分。不仅能维持宿主健康，也能诱导宿主病变。

目前的研究发现，紊乱的肠道菌群会导致代谢紊乱、高血压、感染和神经系统疾病等。因此，通过某些治疗手段调节肠道菌群，进而治疗疾病成为了一个热门的研究方向。无论您是经费紧张的青椒，还是想要小试牛刀的大牛，想要最快进入这一热门领域的方法就是通过微生物测序。宏基因组太贵，16S 菌群多样性刚刚好。

接下来我们就通过文献一起学习如何利用 16S 测序技术研究肠道菌群移植和疾病治疗之间的关系。在文献解读的过程中，我们也会谈到样本准备的思路哦，一起往下学习起来吧。

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关于肠道菌群移植（FMT）治疗帕金森病便秘患者的研究 | 菌群多样性专题


论文标题：Evaluation of fecal microbiota transplantation in Parkinson’s disease patients with constipation

发表杂志：Microbial Cell Factories

影响因子：6.352

研究机构：南京医科大学附属苏州医院

研究背景：

帕金森症（Parkison's disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，多发于老年人，其临床表现主要包括静止性震颤、行动迟缓、肌强直、姿势步态障碍和胃肠道功能障碍等。目前我国帕金森症的平均发病年龄为 60 岁左右，其中 65 岁以上人群患病率约为 1.7%。预计到 2030 年，患病人数将达到近 500 万人。

目前的医疗手段只能缓解帕金森症症状，无法彻底治愈。近年来，各国研究学者证明帕金森症可能与肠道菌群有关，肠道菌群的组成及代谢产物的变化都可能导致患者病情恶化。因此，调节患者肠道菌群或许是治疗帕金森症的一种潜在的疗法。

肠道菌群移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）是一种调节肠道菌群失衡的治疗方式，通过将健康人的肠道菌群移植到患者肠道内，使患者得以重新拥有健康稳定的肠道菌群，以实现对肠道及肠道外疾病的治疗。

结果展示：

本实验招募了 11 例有便秘症状的 PD 患者和 13 例 HC（healthy controls）对照人群参加研究。

首先是根据疗效评定标准及不良事件观察收集临床数据，从表型角度研究肠道菌群移植对患者的疾病严重程度、日常生活活动能力等各方面的影响。先直观的从表型层面确认此治疗方案对于 PD 患者是否有改善作用（见下文一、二部分）。

接着利用 16S 测序技术研究 PD 患者治疗前后的微生物群落变化，并鉴定出不同组间的显著微生物菌群，最后对这些治疗后发生了变化的菌属进行阐述和讨论（详见下文三、四部分）。

16S 测序样本数建议：人类肠道、粪便样品在不同个体之间的差别较大，建议每组至少 10 个生物学重复，如果条件允许，建议加大取样量，每组大于 30 个生物学重复（取样少，可能会导致组内差异大于组间差异则项目无意义）。

一、比较 PD 患者在 FMT 治疗前后的评估分级变化

FMT 治疗 6 周、12 周后，PD 患者的 H-Y Grade、UPDRS II Score、PAC-QOL Score、Wexner constipation score、NMSS 评估分级都发生了降低，而且 FMT 治疗 12 周后的分级与治疗前相比显著降低（Table 2）。

说明：
H-Y Grade：帕金森症分级评估，分级越高，代表疾病越严重；
UPDRS II Score：统一帕金森症分级量表评分，分级越高，代表疾病越严重；
PAC-QOL Score：便秘患者生存质量量表，分级越高，代表疾病越严重；
Wexner constipation score: 便秘评分量表，分级越高，代表疾病越严重；
NMSS：非运动症状评估表，分级越高，代表疾病越严重；
HCY：同型半胱氨酸，心脑血管疾病的危险因子，高 HCY 与 PD 有关；

二、评估 FMT 治疗的有效性和安全性

在治疗过程中，所有病例均为轻微（轻度腹泻 9.1%、腹痛 27.3%、嗳气 18.2%、肠胃气胀 45.5%、恶心 27.3%、咽喉刺激 18.2%），无一例导致停止治疗。在随访期间，有一定比例（腹痛 18.2% 和肥胖 18.2%）的不良事件，但具有自限性，并不严重（Table 4）。


三、比较 PD 患者在 FMT 前和 FMT 后 12 周的微生物群落结构变化

为了深入分析肠道菌群的变化，作者采集 11 例患者（包括 FMT 前和 FMT 后 12 周）和 13 例 HC（healthy controls）的粪便样本进行 16S rDNA 测序。

通过比较不同组之间的群落丰富度（chao1 index）和多样性（Shannon 指数）来看，FMT 治疗 12 周和 FMT 治疗前的菌群多样性具有显著性差异（p < 0.01），并且 FMT 治疗 12 周后的菌群多样性和 HC 已无显著差异（Fig, 2a,b）。

接着，作者利用 LEfSe 分析鉴定不同组间的显著微生物菌群。FMT 治疗前以拟杆菌门为主，包括纲目科属水平各水平的拟杆菌。然而，FMT 治疗 12 周后在科水平的优势菌属是 Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae 和 Lachnospiraceae，分别属于放线菌门和厚壁菌门。在属水平的优势菌属是 Collinsella、Eubacterium__hallii_group、Ruminococcus_1、Dorea、 Blautia、Romboutsia（Fig, 2c,d）。

为了确定肥胖患者的临床参数与肠道微生物群变化之间的相关性，作者选取了 3 个临床指标（BMI、年龄、性别）和属水平菌属计算斯皮尔曼等级相关系数。结果发现，[Eubacterium]_hallii_group、Blautia、 Dorea 和 BMI 显著正相关，Subdoligranulum 和年龄显著正相关，Veillonella 和年龄显著负相关，Lachnoclostridium 和性别显著正相关（Fig, 2e）。


四、粪便微生物群落的整体分析和讨论

最后，作者进一步分析和讨论了 FMT 治疗前后属水平菌属的变化。

随着 FMT 治疗时间延长，拟杆菌属（Bacteroides）的丰度逐渐地显著下降（Fig, 3b），不再是优势菌属（Fig, 2c,d）。这和 Keshavarzian 等的研究结论是相似的。

同样地，埃希杆菌-志贺菌属（Escherichia–Shigella）随着 FMT 治疗时间延长，埃希杆菌-志贺菌属的丰度也是显著下降。这与 Vascellari S 等的研究结论是相似的，并且 Vascellari S 发现随着埃希杆菌-志贺菌属丰度的下降，PD 患者的临床症状得到了缓解。

然而，布劳特菌属（Blautia）随着 FMT 治疗时间延长，丰度却显著升高（Fig, 3e），这也与其在 FMT 治疗 12 周后成为优势菌属的结论相吻合（Fig, 2c）。结合斯皮尔曼等级相关系数的结果（Fig, 2e），我们推测 Blautia 丰度的降低可能与 FMT 或 BMI 有关。

有意思的是，粪杆菌属（Faecalibacterium）在 FMT 治疗 12 周后的丰度比治疗前显著升高，但是其在治疗 8 周后丰度却有一定程度的下降（Fig, 3c），可能说明 FMT 治疗需要一定的周期去保证治疗效果。另外，之前的研究也发现 [2、3]，FMT 治疗前的 PD 患者 Faecalibacterium 丰度显著降低，而 Faecalibacterium 是一种具有抗炎特性的有益肠道菌。对于建立患者肠道菌群的稳态具有意义。


五、总结

FMT 可有效改善患者的帕金森症症状，安全有效且副作用较少。其可能是重建帕金森症患者肠道菌群、延缓疾病进展、提高生活质量的一种有效治疗方法。

六、参考文献

1、Keshavarzian A, et al. Colonic bacterial composition in Parkinson’s disease. Mov Disord. 2015;30(10):1351–60.
2、Unger MM, et al. hort chain fatty acids and gut microbiota difer between patients with Parkinson’s disease and age-matched controls. Parkinson‑ism Relat Disord. 2016s;32:66–72.
3、Soret R, et al. Short-chain fatty acids regulate the enteric neurons and control gastrointestinal motility in rats. Gastroenterology. 2010;138(5):1772–82.
4、Vascellari S, et al. Clinical phenotypes of Parkinson’s disease associate with distinct gut microbiota and metabolome enterotypes. Biomolecules. 2021;11:2.

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