简介

质粒 DNA 是染色体 (或拟核) 外稳定存在且有自主复制能力的遗传物质，广泛存在于细菌、真菌和酵母菌等生物体内。一般细菌内的质粒 DNA 是以超螺旋 (SC) 构型存在，然而在提取和纯化过程中，质粒会发生不同程度的降解，单链断裂会使 SC 构型转变成开环 (OC) 构型，双链断裂会变成线性 (L) 构型 (见图 1)。其中 SC 构型的质粒最稳定，且在细胞中的转化和表达效率也最高，也是衡量产品质粒的重要指标。近年来，随着 DNA 疫苗、mRNA 疫苗和基因治疗产业迅猛发展，对于高纯度、高质量、高规格的超螺旋质粒需求不断增加。


图 1 pDNA 的不同构型

质粒大量制备流程

目前质粒的纯化工艺已经有了深入的研究，其中经典三步层析法被证实是高效、稳健、平台化的工艺方法，具有操作简单、高纯度、适用性广、易放大等特点，可满足工业化大规模克级别的质粒纯化。安升达采用经典三步法层析进行大规格质粒纯化，流程如下图所示：


图 2 安升达三步法质粒纯化流程

1、菌体扩增

若想得到大量的目标 pDNA 通常需要借助大肠杆菌规模化高密度发酵来实现，该技术通过提高发酵罐内的菌体浓度，提高菌体的生物量，从而达到高目标产物的目的。高密度发酵一方面提高了发酵罐的使用效率及目标产物的量；另一方面也给下游的分离纯化带来了便利，比如降低了分离纯化的成本。高密度发酵对发酵设备和发酵条件均有较高的要求，影响发酵的因素也非常多，如感受态、培养基、营养物质、溶氧浓度、培养温度、发酵液的 pH 及补料方式等。选用 DH5a 及 TB 培养基，通过补料及过程控制，通常培养 20-24 h，OD600 可达 150-180 左右。

2、菌体回收

根据发酵液的体积一般可选择离心或过滤的方式进行菌体收集。离心具有速度快、液相澄清度好和效率高等优点，但是离心在大规模生产中难以形成放大工艺，而且还伴随着较强的剪切力，会对质粒的质量造成影响。相对来说中空纤维切向流过滤收菌的方式更得到大家的青睐。开放式流道的中空纤维不仅能够处理高固含量、高粘度、剪切力敏感的料液，而且可线性放大，工艺生产中一般选择 0.1-0.2μm 的中空纤维来回收菌体。

3、菌体裂解

菌体裂解的方法有多种，如煮沸法、去污剂裂解法和碱裂解法等，其中最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。根据菌的重量按照 1:1:1 的比例加入 P1，P2 和 P3 的量，需要注意的是加完 P1 之后需悬浮均匀，若悬浮不彻底，将会导致裂解不完全，这也是成为蛋白质残留的最大根源；加完 P2 之后动作应温和及控制裂解时间，剧烈摇晃和裂解时间较长会造成基因组断裂，导致基因组污染及 pDNA 的不可逆变性，而 pDNA 的不可逆变性则会降低超螺旋比例。


图 3 碱裂解成分及作用

4、裂解液澄清及浓缩

由于在碱裂解过程中加入大量的 P1,P2,P3，使得裂解液体积过大，在层析纯化前进行澄清和浓缩，不仅可以大大减小样品体积，还可以有效去除 RNA、细胞碎片和变性蛋白、宿主 DNA 等杂质，减小层析阶段的负荷。澄清一般可通过离心、微滤或深层过滤的方式；浓缩可选择中空纤维柱切向流过滤系统，中空纤维柱剪切力低，不会破坏质粒超螺旋构象，且能够连续进液，是浓缩的一种理想选择。

5、层析法精纯

经过一系列初级分离处理后，大部分杂质虽然得以去除，但浓缩的上清中仍然含有基因组 DNA、RNA、蛋白质、内毒素和其他构型 (变性) 的质粒。然而，这些杂质和质粒 DNA 的性质很相似，如带负电 (RNA、基因组 DNA 和内毒素)、相近的尺寸 (基因组 DNA 和内毒素) 和疏水性 (内毒素) 等，这也为纯化过程带来了巨大的挑战。大规模 pDNA 精纯的首先方法是层析法，层析分离是利用质粒的分子量、带电性、疏水性和结构特性 (超螺旋) 等与其他杂质的差异进行分离的方法，由于其分辨率高、可重复性好，往往用于高附加值产品的分离。目前，用于质粒 DNA 分离纯化的层析方法主要包括：尺寸排阻层析、离子交换层析和亲和层析等。

5.1 尺寸排阻层析

尺寸排阻层析 (Size-exclusion chromatography，SEC) 是一种按分子量差异进行分离的液相层析方法，又称为凝胶层析或分子筛，通常单独使用或者与其他层析串联使用。填料一般多为 SepHarose 6 Fast Flow，分离效果受盐溶液的类型和浓度影响。一般分子量大的先流出层析柱，分子量小的则在层析柱中停留较长时间，进而实现溶液中各组分的分离。由于 pDNA 和染色体 DNA 的分子量远远大于 RNA 分子，因此可以用分子排阻层析来去除裂解澄清液中 RNA 分子。


图 4 尺寸排阻层析分离示意图

5.2 亲和层析

亲和层析 (Affinity chromatography,AC) 是基于 pDNA 或杂质与特异性配基之间的亲和相互作用 (分子识别) 选择性分离纯化超螺旋质粒 DNA 的色谱方法。配基和目标生物分子之间的相互作用包括静电作用、疏水作用、氢键、范德华力、配位键和弱共价键等，可利用竞争性配体进行特异性洗脱，也可采用改变 pH 值、离子强度和极性等非特异性洗脱方式进行洗脱。嗜硫亲和层析利用电子供体和电子受体之间的相互作用来分离纯化 sc DNA，这种作用力在高盐环境下得以加强，在低盐环境下减弱。3，8-二氨基-6 苯基菲啶 (DAPP)-琼脂糖固定相对 sc DNA 有很大的亲和力，能将其与活性较低的 oc DNA 和 L 构型质粒分开。亲和层析法具有选择性高、特异性好和分辨率高等优势，在质粒纯化和分析中深受研究者的青睐。

5.3 离子交换层析

经过前两步层析，质粒的纯度和均一性 (超螺旋比例) 都已达到生产要求，最后一步层析重点是去除内毒素和痕量杂质。离子交换层析法 ( Anion Exchange Chromatography，AEC) 是根据分子表面电荷 (种类、数目和分布) 的差异实现对不同物质的分离，是生物大分子分离纯化最常用的方法。超螺旋质粒带有高密度的负电荷，可以在高盐浓度下与强阴离子交换填料结合，而内毒素在高盐的条件下不会与阴离子交换色谱柱配基结合，例如 SOURCE 30Q，因此在质粒的纯化工艺中，经常使用阴离子交换色谱来去除内毒素。

6、浓缩脱盐

层析后得到的质粒可能存在盐污染，且在后续实验中，如做成制剂或者进行下一部反应时，一般需要在特定的浓度下和特定的溶液中，这时需要使用超滤来进行脱盐、换液和浓缩处理。超滤膜包具有浓缩生物大分子 (重组蛋白、质粒、病毒等)、透析、脱盐和缓冲液置换等功能，高截留效率最大化保证产品的效率。安升达使用超滤膜包对质粒进行处理，确保纯化后的质粒无盐污染，达到指定的质粒浓度，同时更换缓冲液。

安升达三步法质粒制备案例分享

生产中有一 AAV 困难订单质粒，使用常规流程纯化无法满足客户的产量及超螺旋单体比例等高要求。通过上述三步法纯化流程，AAV 困难订单质粒一次纯化产量为 48.9mg，内毒素含量为 3.5 EU/mg(层析图谱见图 5；各阶段产物电泳图见图 6)。目前质粒的拓扑结构分析方法主要有 HPLC、AGE(琼脂糖凝胶电泳)、CGE(毛细管凝胶电泳) 三种，根据 AGE 和 HPLC 结果综合分析，该 AAV 质粒的超螺旋单体比例为 97.7%(图 6)。


图 5  三步法纯化层析图谱


图 6 AGE 和 HPLC 法检测质粒超螺旋单体比例

安升达可在较短时间内为客户提供高产量、高纯度的质粒。在充满挑战的科研道路上，安升达质粒纯化与大家携手前行。


参考文献

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安升达拥有一站式基因分析设计平台，基因合成完成率达 99.9%，仅需提交核苷酸或氨基酸序列，就能够轻松地合成（自然界）已存在的序列、经密码子优化后的序列、特殊位点突变的基因、人工设计的 DNA 序列，基因突变文库以及研究所需的其他序列。针对不同的合成长度和基因合成不同的应用方向，安升达可提供个性化的合成方案。